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Feb 02, 2024

Los ooquistes de Plasmodium berghei poseen rutas de síntesis y eliminación de ácidos grasos.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12700 (2023) Citar este artículo Detalles de métricas Los parásitos de la malaria llevan a cabo la síntesis de ácidos grasos (FAS) en su orgánulo apicoplasto a través de una bacteria.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12700 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Los parásitos de la malaria llevan a cabo la síntesis de ácidos grasos (FAS) en su orgánulo apicoplasto a través de una vía enzimática relacionada con bacterias (tipo II). En el huésped vertebrado, las etapas exoeritrocíticas de Plasmodium dependen del FAS, mientras que las etapas intraeritrocíticas dependen de la eliminación de FA de su entorno. En el mosquito, los ooquistes de P. falciparum expresan y dependen de las enzimas FAS para la formación de esporozoitos, pero los ooquistes de P. yoelii no expresan ni dependen de las enzimas FAS y, por lo tanto, dependen de la eliminación de FA para sustentar la esporogonia. En P. berghei, las enzimas FAS son igualmente prescindibles para la esporogonia, lo que indica que se ajusta al escenario de P. yoelii. Aquí mostramos que P. berghei, inesperadamente, expresa enzimas FAS durante todo el desarrollo de los oocistos. Estos hallazgos indican que P. berghei puede emplear FAS junto con la eliminación de FA para maximizar la esporogonia y la transmisión, y es más similar a P. falciparum de lo que se suponía anteriormente con respecto a la adquisición de FA por parte del ooquiste. La capacidad de los ooquistes para cambiar entre FAS y carroñero podría ser un factor importante en la relación no competitiva de explotación de recursos entre los parásitos Plasmodium y sus mosquitos vectores, lo que da forma a la virulencia del parásito tanto en el insecto como en el vertebrado.

La malaria sigue siendo una enfermedad infecciosa potencialmente mortal causada por la infección con parásitos apicomplejos del género Plasmodium, siendo P. falciparum la más mortífera entre varias especies de parásitos de la malaria humana. Los síntomas clínicos son causados ​​por parásitos asexuales en etapa sanguínea (intraeritrocíticos), un pequeño porcentaje de los cuales se convierten en células precursoras de la etapa sexual (gametocitos) que facilitan la transmisión por mosquitos. La transmisión del parásito de la malaria comienza con la absorción de gametocitos masculinos y femeninos con la sangre por parte de un mosquito hembra. Los principales pasos del desarrollo que tienen lugar dentro del insecto son: (i) gametogénesis y fertilización en la luz del intestino medio; (ii) transformación de los cigotos en formas móviles alargadas denominadas ookinetes; (iii) cruce del epitelio del intestino medio por los ocinetos, seguido de su transformación en ooquistes jóvenes; (iv) crecimiento y división de los ooquistes para generar miles de esporozoitos, proceso llamado esporogonia; (v) salida de esporozoitos del ooquiste y su colonización de las glándulas salivales del mosquito. Después de una picadura exitosa de mosquito infectado con esporozoitos, se desarrollan parásitos asexuales en etapa hepática (exoeritrocíticos) a partir de los cuales se inician nuevas infecciones en etapa sanguínea para completar el ciclo de vida de Plasmodium.

Los ácidos grasos (AG) son componentes celulares esenciales necesarios para la biosíntesis de las membranas celulares y las moléculas de señalización. Los parásitos de la malaria adquieren FA tanto por síntesis de novo como por captación o eliminación de sus entornos. La síntesis de ácidos grasos de cadena corta a media (FAS) se lleva a cabo en el orgánulo apicoplasto, un cloroplasto relicto, y la elongación adicional de FA (FAE) para generar FA de cadena larga se lleva a cabo en las membranas del retículo endoplásmico (ER), utilizando dos vías enzimáticas paralelas y funcionalmente relacionadas (Fig. 1)1. Un elemento central de FAS es un ciclo enzimático de cuatro pasos que implica: (i) condensación de la proteína portadora de acil-acilo (acil-ACP) con acetoacetil-ACP, catalizada por la acil-ACP elongasa (FabB/F, PBANKA_0823800); (ii) reducción de cetoacil-ACP, catalizada por cetoacil-ACP reductasa (FabG, PBANKA_0823800); (iii) deshidratación de hidroxiacil-ACP, catalizada por hidroxiacil-ACP deshidratasa (FabZ, PBANKA_1338200); (iv) reducción de enoil-ACP, catalizada por enoil-ACP reductasa (FabI, PBANKA_1229800) (Fig. 1). FAE utiliza una vía enzimática similar conducida por un conjunto diferente de proteínas y emplea coenzima A (CoA) en lugar de ACP como portador de acilo (Fig. 1).

Vías enzimáticas implicadas en la síntesis de ácidos grasos (FAS) y el alargamiento (FAE) en Plasmodium. Las enzimas involucradas en la catálisis se muestran en fuente roja. FabB/F, acil-ACP elongasa; FabG, cetoacil-ACP reductasa; FabZ, hidroxiacil-ACP deshidratasa; FabI, enoil-ACP reductasa; ELO-A/B/C, acil-CoA elongasa A/B/C; KCR, cetoacil-CoA reductasa; DEH, hidroxiacil-CoA deshidratasa; ECR, enoil-CoA reductasa.

Para los parásitos de la malaria, la síntesis de membranas es especialmente importante para las fases de multiplicación del ciclo de vida, es decir, durante la esquizogonia en el huésped vertebrado y durante la esporogonia en el mosquito vector. Los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium no expresan enzimas FAS2,3 y la eliminación de los genes que codifican la enzima FAS muestra que son redundantes para el desarrollo del parásito en estadio sanguíneo2,3,4. Por lo tanto, las etapas sanguíneas deben depender de los AG que eliminan su entorno para su desarrollo. En marcado contraste, las etapas del parásito preeritrocítico expresan enzimas FAS y su agotamiento resulta en una detención del desarrollo, lo que demuestra que las etapas hepáticas dependen de FAS para su desarrollo1,2,3,4. La situación en el mosquito es más compleja y los estudios han revelado diferencias entre las especies de parásitos, particularmente durante la esporogonia en el ooquiste. En el parásito de la malaria humana P. falciparum, FabI se expresa en ooquistes y el agotamiento genético de FabI o FabB/F afectó negativamente el desarrollo de ooquistes maduros y abolió la formación de esporozoitos4. Estas observaciones muestran que los ooquistes de P. falciparum dependen del FAS para su diferenciación normal. Por el contrario, la expresión de la enzima FAS no se detectó en ooquistes de la especie de parásito de la malaria en roedores P. yoelii y, de acuerdo con este patrón de expresión, el agotamiento de FabB/F o FabZ no afectó el desarrollo de ooquistes o esporozoitos3. En consecuencia, los ooquistes de P. yoelii parecen depender de la eliminación de FA para apoyar el desarrollo normal y la esporogonia de los ooquistes.

Si bien los ooquistes de P. yoelii y P. falciparum claramente utilizan estrategias diferentes para la adquisición de FA basadas principalmente en la eliminación y la síntesis, respectivamente, existe evidencia circunstancial que sugiere que los ooquistes de P. falciparum pueden utilizar la eliminación de FA junto con el FAS: crecimiento de ooquistes de P. falciparum y esporozoito La formación de lípidos es sensible a la reducción artificial de los niveles de lípidos en el insecto, que se logra mediante la eliminación del ARNi del principal transportador de lípidos del mosquito, la lipoforina5,6,7. Además, el aumento de los niveles de lípidos de la hemolinfa del mosquito mediante la alimentación adicional de sangre después de la ingesta inicial de sangre infectada promueve significativamente el crecimiento y la maduración de los ooquistes de P. falciparum6,8,9. En otro parásito de la malaria en roedores, P. berghei, se demostró que los parásitos mutantes nulos de FabG forman números normales de ooquistes y producen esporozoitos1, lo que apunta a una función redundante de FabG (y, por lo tanto, de FAS) en la etapa de ooquiste y, por lo tanto, de una adquisición de FA. escenario similar al de la especie estrechamente relacionada P. yoelii. En este artículo, sin embargo, mostramos que los oocistos de P. berghei, al igual que los de P. falciparum, expresan proteínas residentes en apicoplastos de la maquinaria FAS. Estos hallazgos respaldan la idea de que la adquisición de FA por parte de los ooquistes, al menos en algunas especies de Plasmodium, incluido P. falciparum, implica una interacción sutil entre la síntesis y la eliminación para maximizar la esporogonia y la transmisión.

Recientemente demostramos que el orgánulo cristaloide de P. berghei, que se encuentra exclusivamente en las etapas de ookinete y ooquiste joven, se adapta a la enzima generadora de NADPH NAD (P) transhidrogenasa (NTH), que también está presente en el apicoplasto del esporozoito aguas abajo10. Como la enzima FAS FabG depende de NADPH (Fig. 1), investigamos si, como NTH, también se encuentra en cristaloides. Para hacerlo, se generó una línea de parásito transgénico que expresaba FabG fusionada en su extremo carboxi a GFP. La PCR de diagnóstico a través del sitio de integración 5' amplificó un fragmento de aproximadamente 2,4 kb del tamaño esperado (Fig. 2), lo que confirma la integración del alelo fabg::gfp modificado en el locus objetivo de la línea de parásito FabG/GFP resultante. Además, la ausencia del alelo fabg parental en poblaciones clonales de FabG/GFP se confirmó mediante PCR de diagnóstico (Fig. 2).

Generación y genotipado de líneas de parásitos transgénicos de P. berghei. (A) Diagrama esquemático de los alelos fabg modificados en la línea del parásito FabG/GFP generados por recombinación homóloga de cruce simple. El gen fabg se muestra en gris con la secuencia codificante (barras anchas) y las regiones no traducidas 5' y 3' (barras estrechas). También se muestran el sitio de restricción PacI utilizado para la recombinación homóloga de cruce único, el módulo gfp, el marcador seleccionable (hdhfr) y las posiciones de los cebadores P1-P3 utilizados para la amplificación por PCR de diagnóstico. Tenga en cuenta que esta estrategia deja un segundo alelo fabg sin modificar. (B) PCR con los cebadores P1 y P3 de diagnóstico para la integración de los alelos fabg::gfp modificados en el locus fabg, o con los cebadores P1 y P3 de diagnóstico para la ausencia del alelo fabg parental no modificado. (C) Diagrama esquemático del alelo kcr modificado en la línea del parásito KCR/GFP generado por recombinación homóloga de doble cruce. El gen kcr se muestra en gris con la secuencia codificante (barras anchas) y las regiones 5' y 3' no traducidas (barras estrechas). También se muestran el módulo gfp, el marcador seleccionable (hdhfr) y las posiciones de los cebadores P4-P6 utilizados para la amplificación por PCR de diagnóstico. (D) PCR con los cebadores P4 y P5 de diagnóstico para la integración de los alelos kcr::gfp modificados en el locus kcr, o con los cebadores P6 y P5 de diagnóstico para la ausencia del alelo kcr parental no modificado. Consulte la sección de Métodos para conocer las secuencias de cebadores. Las imágenes en tamaño completo de los geles de ADN agarosa están disponibles en la Información complementaria.

La evaluación de la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia confocal de parásitos FabG/GFP vivos reveló una falta de fluorescencia de GFP en los parásitos en etapa sanguínea, gametos y ookinetes (datos no mostrados), lo que indica que la expresión de FabG está ausente o es muy baja en estas etapas de la vida. Esta observación es consistente con los datos del transcriptoma reportados para el gen fabg de P. berghei, que muestran niveles de transcripción muy bajos en parásitos en etapa sanguínea11. Sin embargo, sorprendentemente, la expresión de FabG se detectó fácilmente en ooquistes jóvenes (Fig. 3A). La fluorescencia se localizó en una estructura tubular ramificada que recuerda al apicoplasto (Fig. 3A), de acuerdo con la localización de FAS en este orgánulo. FabG::GFP permaneció localizado en el apicoplasto durante todo el desarrollo de los ooquistes y en ooquistes esporulados ubicados en puntos discretos, lo que probablemente refleja la división de la red tubular de apicoplastos en pequeños apicoplastos individuales durante la gemación de los esporozoitos (Fig. 3A)12. Estos resultados muestran claramente que, en P. berghei, FabG está presente en ooquistes y esporozoitos de ooquistes, lo cual fue inesperado en vista de la ausencia reportada de expresión de FabG en las mismas etapas del ciclo de vida de la especie de parásito relacionada P. yoelii, donde FabG está presente. observado por primera vez en el apicoplasto de los esporozoítos de las glándulas salivales3. Como las enzimas FAS operan en un complejo, investigamos si otros componentes de este complejo enzimático se expresaban en oocistos de P. berghei. Para ello, buscamos la presencia de ARNm específico de los genes que codifican FabB/F, FabZ y FabI en ooquistes no esporulados, mediante transcripción inversa PCR13. De hecho, se amplificaron por PCR fragmentos de ADN de los tamaños esperados para las cuatro especies de ARNm investigadas (incluido el ARNm que codifica FabG como control positivo) (Fig. 3), lo que confirma la expresión en ooquistes de los cuatro genes específicos de FAS. Estos resultados respaldan la idea de que P. berghei tiene un aparato FAS operativo durante todo el desarrollo de los ooquistes, ubicado en el apicoplasto.

Expresión de enzimas FAS en oocistos de P. berghei. (A) Fluorescencia confocal de GFP e imágenes de campo claro de oocistos no esporulados (4 y 8 días después de la infección) y esporulados (14 días después de la infección) de la línea de parásitos FabG/GFP (clon 1). Barra de escala de 5μm. (B) PCR de transcripción inversa de muestras de oocistos de tipo salvaje no esporulados con cebadores específicos para ARNm de genes que codifican FabB/F, FabG, FabZ y FabI, amplificando fragmentos de 639, 769, 562 y 750 pb, respectivamente. Una imagen en tamaño completo del gel de ADN agarosa está disponible en la Información complementaria.

La función redundante informada de FabG, y por lo tanto de FAS, en ooquistes1 estaba, a primera vista, en desacuerdo con la expresión específica de ooquistes de FabG en P. berghei (Fig. 3). Una posible explicación es que la pérdida de FabG en estos ooquistes se compensa con la otra cetoacil reductasa codificada por el parásito: KCR (PBANKA_0522400), que normalmente forma parte de FAE (Fig. 1). En particular, se informa que los parásitos mutantes nulos KCR de P. berghei producen ooquistes que son incapaces de formar esporozoitos1, un fenotipo que es muy similar al de los mutantes nulos de las enzimas FabI y FabB/F en P. falciparum4. Para probar esta hipótesis, generamos una línea de parásito transgénico que expresa KCR fusionado a GFP en su extremo carboxilo mediante reemplazo alélico del gen kcr de tipo salvaje (Fig. 2C). La PCR de diagnóstico a través del sitio de integración 3' amplificó un fragmento de aproximadamente 2 kb del tamaño esperado (Fig. 2D), lo que confirma la integración del alelo kcr::gfp modificado en el locus objetivo de la línea de parásito KCR/GFP resultante. Además, la ausencia del alelo kcr de tipo salvaje en poblaciones clonales de KCR/GFP se confirmó mediante PCR de diagnóstico (Fig. 2D).

La expresión de transcripción informada del gen kcr en parásitos en etapa sanguínea de P. berghei mostró niveles más altos en gametocitos femeninos11,14 y se predice que su ARNm estará sujeto a represión transcripcional15. Estos datos fueron indicativos de que la proteína KCR se expresaba después de la fertilización. De acuerdo con esto, la microscopía de fluorescencia viva de la línea de parásitos KCR/GFP reveló su expresión en oikinetes (Fig. 4A). El fenotipo 1 de pérdida de función de KCR señaló además su expresión en ooquistes, y esto fue confirmado por la presencia de fluorescencia basada en KCR :: GFP en estas etapas de la vida (Fig. 4B, C). La línea de parásitos KCR/GFP formó esporozoitos y la fluorescencia basada en KCR::GFP en esporozoitos en ciernes y en ooquistes completamente esporulados fue notablemente más débil que en el esporoblasto de ooquiste (Fig. 4D, E), lo que indica que la expresión de KCR está regulada negativamente, pero no ausente. en esporozoitos. El desarrollo normal de esporozoitos en la línea de parásitos KCR/GFP indica que la fusión de GFP no afectó negativamente a la función de KCR y, por tanto, a la localización subcelular de la proteína. La localización de la fluorescencia basada en KCR::GFP era distinta de la supuesta localización específica de apicoplasto de FabG y, en cambio, mostraba una distribución subcelular más amplia consistente con una localización en las membranas del ER (Fig. 4). Esta supuesta localización está de acuerdo con la estructura predicha de KCR, que posee una hélice transmembrana amino-terminal y una señal de retención de ER de di-lisina carboxi-terminal además de su dominio enzimático central compartido con FabG. La distinta localización subcelular de KCR hace que sea poco probable que pueda compensar la pérdida de FabG en el mutante nulo de FabG de P. berghei1, lo que sugiere que no existe una superposición funcional entre FAS y FAE en el ooquiste. Por lo tanto, el fenotipo mutante nulo KCR de P. berghei informado1 apunta a un papel esencial de FAE en la formación de esporozoitos dentro del ooquiste. Se informó un fenotipo de pérdida de función similar para la enzima FAE DEH (Fig. 1) en P. berghei16. En conjunto, estas observaciones indican que los ooquistes de P. berghei dependen de FAE y son incapaces de obtener niveles mínimos o suficientes de FA de cadena larga de su entorno.

Expresión de KCR en P. berghei. Fluorescencia confocal de GFP e imágenes de campo claro de la línea de parásitos KCR/GFP (clon 1), que muestran (A): un ookete maduro; (B): grupo de tres ooquistes jóvenes a los 4 días postinfección; (C): un ooquiste no esporulado a los 8 días de la infección; (D) un ooquiste esporulado 14 días después de la infección; (E) un ooquiste completamente esporulado 14 días después de la infección. Barra de escala de 10μm.

La aparente diferencia en la expresión de FabG entre P. berghei (Fig. 3) y P. yoelii3 fue sorprendente dada la estrecha relación evolutiva entre estas dos especies de parásitos de la malaria en roedores. Cabe señalar que se utilizaron diferentes técnicas para visualizar la expresión y localización de FabG, a saber, etiquetado GFP combinado con microscopía de fluorescencia viva (P. berghei) y etiquetado myc combinado con inmunofluorescencia (P. yoelii), que pueden haber contribuido a estos resultados confusos. . Mientras que el primer método deja poco margen para resultados falsos positivos, la tinción del ooquiste interno mediante inmunofluorescencia es más difícil debido a la cápsula del ooquiste, que es poco permeable a los anticuerpos. Sin embargo, tomados al pie de la letra, los resultados presentados aquí revelan que P. berghei ocupa una posición intermedia entre P. yoelii y P. falciparum con respecto a la expresión de la enzima FAS y la dependencia de FAS en las etapas de oocistos. Los ooquistes de P. berghei claramente pueden utilizar la eliminación de FA de la hemolinfa del mosquito para apoyar el desarrollo de ooquistes y esporozoitos en ausencia de FAS1 operativo. ¿Por qué entonces los ooquistes de P. berghei invierten recursos en la expresión de un sistema FAS intacto? Una explicación es que FAS proporciona una ventaja selectiva en condiciones diferentes a las utilizadas durante el análisis de los fenotipos mutantes nulos de FabG1. En este contexto, es importante señalar que, en las infecciones experimentales por mosquitos, a los insectos alimentados con sangre no se les permite poner huevos, lo que da como resultado el reciclaje de nutrientes a través de la resorción folicular y una mayor disponibilidad de nutrientes/lípidos para el desarrollo de ooquistes que en condiciones naturales cuando los huevos normalmente se colocaría. También se podrían alcanzar niveles bajos de FA en hemolinfa en situaciones de altas cargas de ooquistes, cuando el crecimiento de los ooquistes podría agotar los recursos de FA antes de que comience la gemación de los esporozoitos. En tales situaciones, FAS podría actuar para promover/rescatar la formación de esporozoitos y garantizar la transmisión. De hecho, el crecimiento de los ooquistes y la esporogonia de P. berghei se reducen por el hacinamiento, así como por la reducción de los niveles de lípidos en el insecto mediante la eliminación de lipoforinas5,6,17. Si bien la contribución de FAS al desarrollo de ooquistes y a la esporogonia es claramente más importante en P. falciparum que en P. berghei1,4, esto puede ser, en última instancia, una diferencia cuantitativa más que cualitativa entre estas especies de Plasmodium que refleja diferencias biológicas, por ejemplo, en su eficacia. de absorción de lípidos o en sus necesidades generales de AG.

El potencial de los ooquistes de Plasmodium para utilizar FAS junto con la eliminación de FA, como se revela en este artículo, es relevante para la relación no competitiva de explotación de recursos que se ha propuesto que existe entre los parásitos de Plasmodium y sus mosquitos vectores, y que da forma a la virulencia del parásito en ambos. el insecto y el huésped5,7. El tráfico de lípidos de los mosquitos mediante lipoforinas es un factor importante en este proceso5,7. Esta estrategia no competitiva para optimizar la transmisión y al mismo tiempo minimizar el costo de la aptitud reproductiva para el insecto puede lograrse mediante el uso de recursos nutricionales "excedentes" que no se invierten en la ovogénesis, o utilizando dichos recursos solo después de completar la formación de los huevos5,7. La capacidad del parásito para cambiar a FAS podría ser un factor adicional importante. Una mayor disponibilidad de lípidos podría estimular la eliminación de AG, mientras que niveles más bajos de lípidos podrían estimular el FAS, promoviendo en cada caso la esporogonia sin afectar negativamente la aptitud del mosquito y permitiendo que el parásito afine su relación con el mosquito para explotar los nutrientes basados ​​en AG para evolucionar de manera óptima. transmisión. En cualquier caso, el acceso a los AG a través de la síntesis y la eliminación debería darle al ooquiste de Plasmodium una mayor versatilidad para hacer frente a los cambios ambientales dentro del vector.

Como se describió anteriormente10, todo el trabajo con animales de laboratorio se llevó a cabo de conformidad con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 que implementa la Directiva Europea 2010/63 para la protección de los animales utilizados con fines experimentales y fue aprobado por la London School of Hygiene & Tropical. Organismo de Revisión Ética del Bienestar Animal de Medicina y Ministerio del Interior del Reino Unido. Los experimentos generalmente se realizaron en ratones CD1 de 6 a 8 semanas de edad, libres de patógenos específicos y mantenidos en jaulas con filtro, siguiendo las pautas de ARRIVE. El bienestar animal se evaluó diariamente y, al alcanzar los criterios de valoración experimentales o clínicos, los animales fueron sacrificados humanamente mediante exposición a gas dióxido de carbono en una concentración creciente. Los ratones fueron infectados con parásitos suspendidos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección intraperitoneal o mediante picadura de mosquito infectado en animales anestesiados. La parasitemia intraeritrocítica se controló periódicamente mediante micromuestras de sangre de una vena superficial de la cola. Los medicamentos se administraron mediante inyección intraperitoneal o, cuando fue posible, en agua potable. La sangre parasitada se recogió mediante sangrado cardíaco bajo anestesia general sin recuperación.

Los parásitos P. berghei ANKA clon 2.34 se mantuvieron como estabilizados criopreservados o mediante paso sanguíneo mecánico y transmisión regular de mosquitos, como se describió anteriormente10. Los ensayos de infección y transmisión de mosquitos se realizaron como se describió anteriormente utilizando Anopheles stephensi18,19 y los insectos infectados se mantuvieron a 20 °C con aproximadamente 70 % de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h. Se realizaron cultivos de oocinetos durante la noche a partir de sangre de gametocitos como se describe20.

Para generar una línea de parásito que expresa FabG fusionado a GFP (FabG/GFP), se amplificó por PCR un fragmento de aproximadamente 2,2 kb correspondiente a la secuencia codificante (más intrones) y 5'UTR de PBANKA_0823800 con los cebadores FabG-F (TTGGGCTGCAGTCGAGGAATTTCCATAGCATCCATATATAC) y FabG. -R (AATGAGGGCCCCTAAGCTGGTACCACTTGATAATCCACCATCAATTATAAATAC) y se clonó en pBS-EGFP-hDHFR10 digerido con SalI/HindIII mediante In-Fusion para dar el plásmido pBS-FabG/GFP. Este plásmido se linealizó con PacI y se transfectó en esquizontes purificados para su integración en el locus fabg mediante recombinación homóloga de cruce simple (Fig. 2A).

Para generar una línea de parásito que expresa KCR fusionada a GFP (KCR/GFP), la secuencia codificante de PBANKA_005524 más aproximadamente 0,45 kb de la 5'UTR se amplificó por PCR con los cebadores pDNR-05524-F (ACGAAGTTATCAGTCGAGGTACCTGATTCAACTATATTACCGCAGATAC) y pDNR-05524-R ( ATGAGGGCCCCTAAGCTTTCTTCTTTCTTCATTTTTTTCAAC) y se introdujo en pDNR-EGFP digerido con SalI/HindIII mediante clonación In-Fusion para dar el plásmido pDNR-KCR/EGFP. Una secuencia de aproximadamente 0,77 kb correspondiente a la 3'UTR de PBANKA_005524 se amplificó por PCR con los cebadores pLP-05224-F (ATATGCTAGAGCGGCCAGTGTGCTCACTTTTTGTTATTTTG) y pLP-05224-R (CACCGCGGTGGCGGCCTTTGGAAAATATGCAAAGC) y se introdujo en pLP-hDHFR digerido con NotI mediante clonación In-Fusion. a dar el plásmido pLP-hDHFR/KCR. La secuencia específica de kcr de pDNR-KCR/EGFP se introdujo en pLP-hDHFR/KCR mediante recombinación específica de sitio Cre-loxP para dar la construcción final pLP-KCR/EGFP. Este plásmido se linealizó con KpnI y SacII y se transfectó en esquizontes purificados para su integración en el locus kcr mediante recombinación homóloga de doble cruce (Fig. 2C).

La transfección de parásitos, la selección de pirimetamina y la clonación por dilución limitante se realizaron como se describe21,22.

La extracción de ADN genómico para la PCR de diagnóstico se realizó como se describe19. Para confirmar la integración del alelo fabg modificado etiquetado con GFP en el locus diana, el ADN genómico de la línea del parásito FabG/GFP se sometió a PCR de diagnóstico con los cebadores P1 (ATGTGCAGTGATTTTGCATATCT) y P2 (GTGCCCATTAACATCACC) para amplificar un fragmento de aproximadamente 2,4 kb en todo el locus objetivo. Sitio de integración 5' (Fig. 2A, B). La ausencia del alelo fabg parental no modificado (2,9 kb) se evaluó mediante PCR con los cebadores P1 y P3 (CACCGCGGTGGCGGCCCTTATAAGTATTCTTCTCATATTTCCCGT) (Fig. 2A, B).

Para confirmar la integración del alelo kcr etiquetado con GFP en el locus objetivo, el ADN genómico de la línea del parásito KCR/GFP se sometió a PCR de diagnóstico con los cebadores P4 (ACAAAGAATTCATGGTTGGTTCGCTAAACT) y P5 (CATTAGCATTAGGTTTCATTTCATTAC) para amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kb en los 3 '-sitio de integración (Fig. 2C,D). La ausencia del alelo kcr parental (3,0 kb) se evaluó mediante PCR con los cebadores P6 (ACGAAGTTATCAGTCGAGGTACCTGATTCAACTATATTACCGCAGATAC) y P5 (Fig. 2C, D).

En el archivo de información complementaria se incluyen imágenes de geles de agarosa de ADN de tamaño completo con escaleras de ADN completas, y las regiones utilizadas en la Fig. 2 se indican con cuadros rojos.

Como se describió anteriormente13, aproximadamente 30 An. stephensi que contenían ooquistes tomados siete días después de una ingesta de sangre infectada con P. berghei de tipo salvaje, se diseccionaron y combinaron, y se extrajo el ARN total utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen). Para eliminar la contaminación residual del ADN genómico, las muestras de ARN se sometieron a un tratamiento con ADNasa I (grado de amplificación, Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de una inactivación térmica de la enzima. Después de un segundo paso de limpieza con RNeasy para eliminar la ADNasa I, las muestras de ARN se transcribieron de forma inversa con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (RNasaH menos, mutación puntual, Promega) en presencia de oligo(dT)25 a 50 °C durante 1 h. , seguido de inactivación por calor. Las muestras de ADNc resultantes se purificaron en columna utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en agua. El ADNc específico de la enzima Fab se amplificó por PCR (25 ciclos) con los pares de cebadores CATAATCTGAATAAGGTTAATCCAAATAAG y TACCATATTTGCAATCTCTTCTGG (FabG, tamaño de fragmento 769 pb); GAAGATAACATGTTTCACTAACAATGG y ATACCACCACCATATCCAGGTAC (FabI, tamaño de fragmento 750 pb); TTTTTGGTTCACCAAGTGTATAGC y GCGCATGCACTTAACATACC (FabB/F, tamaño de fragmento 639 pb); GAAACTTTTTATAATTTTTGTTTACGTCC y CACTAATGTATCGCCTGGTAAAAC (FabZ, tamaño de fragmento 562 pb). Estos cebadores se diseñaron para abarcar un sitio de corte y empalme de intrón, cuando sea posible, para garantizar una amplificación específica del ARNm. En el archivo de información complementaria se incluye una imagen de los geles de agarosa de ADN de tamaño completo con la escalera de ADN completa.

Se evaluaron muestras de parásitos vivos y se capturaron imágenes en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM880 utilizando un objetivo de aceite de 100 × y el software ZEN Blue versión 3.0, como se describe10. Se evaluaron y compararon la expresión de proteínas y la localización subcelular en ooquistes de lotes de mosquitos infectados con poblaciones clonadas y no clonadas de parásitos transgénicos para garantizar que los resultados fueran consistentes y representativos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (subvención BB/V006428) y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (subvención MR/P021611).

Estos autores contribuyeron igualmente: Sadia Saeed y Annie Z. Tremp.

Departamento de Biología de Infecciones, Facultad de Enfermedades Infecciosas y Tropicales, Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Keppel Street, Londres, WC1E 7HT, Reino Unido

Sadia Saeed, Annie Z. Tremp & Johannes T. Dessens

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JTD contribuyó con la conceptualización; SS, AT y JTD realizaron una investigación; JTD escribió el artículo y obtuvo financiación.

Correspondencia a Johannes T. Dessens.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Saeed, S., Tremp, AZ & Dessens, JT Los ooquistes de Plasmodium berghei poseen rutas de síntesis y eliminación de ácidos grasos. Representante científico 13, 12700 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39708-z

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Recibido: 29 de mayo de 2023

Aceptado: 29 de julio de 2023

Publicado: 05 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39708-z

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